جنتامایسین جزء خانواده آمینو گلیکوزیدها می باشد و با اثر بر جزء 30s ریبوزوم باکتری و تداخل در ساخت پروتئین ها در ارگانیسم های حساس اثر ضد میکروبی خود را نشان می دهد.

جنتامایسین همانند سایر آمینو گلیکوزیدها عمدتا بر باکتری های گرم منفی نظیر اشرشیاکلی، کلبسیلا، پروتئوس، پسودوموناس، سالمونلا، انتروباکتر، سراتیا، و شیگلا اثر می کند. همچنین بر روی برخی از استافیلوکوک ها و استرپتوکوک ها نیز موثر است.‌

در نشخوارکنندگان جنتامایسین پس از تزریق عضلانی سریعاً جذب می شود نیمه عمر آن 1 تا 3 ساعت است دفع دارو از طریق فیلتراسیون کلیوی و دفع ادرار می باشد. دوز 5 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن هر 8 ساعت در تزریق وریدی یا عضلانی غلظت گردش خونی 5 میکروگرم در هر میلی لیتر ایجاد می کند که برای اثر بر روی ارگانیسم های حساس مورد نیاز می باشد. جنتامایسین نفوذ پذیری کمی درمایع  CSF دارد.‌